實驗共設(shè)置4組內(nèi)徑為7 cm、有效水深為105 cm的柱狀SBR反應(yīng)器。每組反應(yīng)器有效容積為4 L。反應(yīng)器按6 h周期運(yùn)行，其中，進(jìn)水、沉淀、排水時間均為5 min，其余時間曝氣，控制曝氣量使得表觀氣速為1.5 cm/s，不設(shè)置缺/厭氧期。排水口在底部以上52.5 cm處，換水比為50%。反應(yīng)器處于恒溫室內(nèi)，溫度恒定為25 ℃。

接種的絮體活性污泥取自城市污水處理廠，用0.2 mm的篩網(wǎng)過濾后接種至反應(yīng)器，接種后反應(yīng)器內(nèi)污泥濃度MLSS=3 500 mg/L。進(jìn)水為人工配水，進(jìn)水水質(zhì)為(每升)：500 mg乙酸鈉、153 mg NH₄Cl、35 mg KH₂PO₄、30 mg CaCl₂、20 mg MgCl₂、10 mg FeSO₄、1 mL微量元素溶液。微量元素溶液(每升)組分: 0.05 g H₃BO₃、0.05 g ZnCl₂、0.03 g CuCl₂、0.05 g MnSO₄·H₂O·(NH₄)₆、0.05 g Mo₇O₂₄·4H₂O、0.05 g AlCl₃、0.05 g CoCl₂·6H₂O、0.05 g NiCl₂。

根據(jù)實驗的前期預(yù)實驗結(jié)果與相關(guān)參考文獻(xiàn)[10-15]，確定了PAC、MBF、GAC 3種凝聚劑的最佳投加方式。

1) 市售30%(w/w)的PAC粉劑配置成33.33 g/L的PAC溶液，每個周期進(jìn)水時同步投加50 mL PAC溶液，45 d后停止投加。

2) MBF提取自前述污水處理廠的濃縮污泥，提取方法：將TSS=10 g/L的濃縮污泥在-20 ℃和37 ℃條件下反復(fù)凍融3次(單次冷凍或融解的作用時間均為12 h)。然后，將100 mL混合液進(jìn)行超聲細(xì)胞破碎(SCIENTZ-d2 D)，破碎時間2 min，脈沖4 s，功率密度60%。破碎后的混合液在4 ℃，10 000g條件下高速離心20 min，上清液為MBF溶液^[13]。每個周期進(jìn)水時同步投加50 mL MBF溶液，45 d后停止投加。

3) GAC的制備與投加方法：將市售的椰殼活性炭高速破碎后，用篩網(wǎng)篩選出粒徑為0.15~0.25 mm的顆�；钚蕴�。在接種絮體活性污泥時一次性投加，使得反應(yīng)器內(nèi)GAC濃度為3 500 mg/L，后續(xù)不再補(bǔ)加。

用0.1 mol/L磷酸緩沖液(PBS)將顆粒清洗3次后加入100 μL 0.1 mol/L NaHCO₃，然后，用異硫氰酸熒光素(FITC)、刀豆蛋白(Con A)、卡爾科弗盧爾熒光增白劑(calcofluor white)和尼羅紅(Nile Red)分別對蛋白質(zhì)、α多糖、β多糖和脂類進(jìn)行染色^[16]。在上述每次染色后，均用PBS清洗樣品兩次，以除去多余的染色劑。將染色后的顆粒在-20 ℃下冷凍切割成60 μm切片，最后，用CLSM(Leica TCS SP2)掃描沿粒徑方向熒光強(qiáng)度。

用PBS將顆粒清洗3次后，用2.5%戊二醛固定2 h。然后，分別用50%、75%、90%、100%的乙醇初脫水，再分別用50%、75%、90%、100%的叔丁醇深脫水(單種濃度脫水時長均為5 min)。干燥噴金后進(jìn)行SEM(Hitachi S-3 400N)觀察。

顆粒實際抗剪強(qiáng)度沒有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，有研究在厭氧顆粒污泥中采用相對抗剪切強(qiáng)度完整度系數(shù)ICs表征^[17]。本實驗中作部分修改，具體測定方法為：用0.1 mol/L PBS清洗顆粒(100 mL)3次后定容至100 mL。然后將其置于37 ℃、200 rpm的搖床中振蕩30 min。振蕩停止沉淀10 s后迅速吸取并測定上清液和沉淀部分的SS，分別記為SS₁和SS₂。完整度系數(shù)(Integrity coefficients, ICs)ICs= SS₂/ (SS₁+SS₂)。

用PBS清洗3次后的顆粒分別單獨(dú)加入2 350 U/μL蛋白酶K、205 U/μL α淀粉酶、5.13 U/μL β淀粉酶、3.14 U/μL脂肪酶，并在37 ℃、150 rpm條件下振蕩60 min。振蕩停止后，沉淀10 s迅速吸取并測定上清液和沉淀部分的SS，分別記為SS₃和SS₄�？顾�解強(qiáng)度系數(shù)(Anti- hydrolase coefficients, AHCs)AHCs= SS₄/ (SS₃+SS₄)。

TSS、MLSS等常規(guī)指標(biāo)的測定參考《水和廢水監(jiān)測分析方法(第四版)》。顆粒粒徑測定和顯微觀察均使用光學(xué)顯微鏡Motic BA310。顆粒內(nèi)部溶解氧DO分布用微電極(Unisense)測定，梯度選取為40 μm，測定時預(yù)曝氣控制液相DO=6.0 mg/L。PBS緩沖液組分(mmol/L)：NaCl=137，KCl=2.7，Na₂HPO₄=10，KH₂PO₄=2。

研究通過不同強(qiáng)化方法均成功培養(yǎng)出了好氧顆粒污泥(如圖 1所示)。對照組、PAC組、MBF組、GAC組好氧顆粒污泥的初形成(粒徑＞0.2 mm)時間分別為第42天、第30天、第8天、第28天。顆粒成熟(粒徑及各項指標(biāo)基本穩(wěn)定)時間分別為第52天、第39天、第22天、第38天。成熟后的4種好氧顆粒污泥平均粒徑均在1.2~1.8 mm之間，組間無顯著差異。實驗結(jié)果表明：PAC、MBF、GAC對好氧顆粒污泥的形成有促進(jìn)作用，且PAC的促進(jìn)作用最為顯著。

1  4種不同好氧顆粒污泥的光學(xué)顯微觀察和掃描電鏡SEM的表面結(jié)構(gòu)

 

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從圖 1可以看出，4種好氧顆粒污泥的形態(tài)特征在光學(xué)顯微鏡下沒有明顯區(qū)別，均為類球形結(jié)構(gòu)，且表面沒有絲狀菌纏繞。已有研究表明，以乙酸鈉為底物培養(yǎng)的好氧顆粒污泥通常不會觀察到有絲狀菌生長^[18-19]。但4種好氧顆粒污泥的SEM結(jié)果卻顯著不同，其中, 對照組和MBF組的顆粒外層為網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，表面粗糙多孔，較為蓬松。PAC強(qiáng)化型好氧顆粒污泥表面呈層狀花椰菜結(jié)構(gòu)，沒有蓬松網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，且層狀之間排布緊密。GAC強(qiáng)化型好氧顆粒污泥表面整齊排布著球菌、桿菌，沒有網(wǎng)狀、層狀結(jié)構(gòu)，表層光滑致密。

MBF組和對照組表現(xiàn)出相同的表面結(jié)構(gòu)，表明微生物絮凝劑中提取的有效成分(胞內(nèi)外蛋白和多糖)^[13]，主要作用是增加了好氧顆粒污泥形成過程中必要的胞外聚合物的含量，但沒有改變顆�；�的機(jī)理(胞外聚合物假說)。而PAC組和GAC組的表面特性和對照組相比已有顯著改變，且這兩類好氧顆粒污泥之間的表面特性也完全不同。具體的顆粒化機(jī)理在后文結(jié)合EPS熒光原位染色和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性一并詳細(xì)討論。

EPS熒光原位染色結(jié)果如圖 2所示，CLSM掃描結(jié)果表征了蛋白質(zhì)、α多糖、β多糖、脂肪在4種好氧顆粒污泥內(nèi)部沿半徑方向的分布。其中，α多糖和脂肪兩種EPS組分在4種顆粒內(nèi)部的分布規(guī)律一致，都分布在顆粒外層。

2  4種好氧顆粒污泥EPS主要組分的內(nèi)部分布

 

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蛋白質(zhì)在對照組和MBF組的顆粒內(nèi)部均勻分布；PAC強(qiáng)化型顆粒外層(0~200 μm)的蛋白質(zhì)染色劑熒光強(qiáng)度為對照組的2.5倍，內(nèi)部(300~600 μm)熒光強(qiáng)度與對照組一致；GAC強(qiáng)化型顆粒外層(0~150 μm)的蛋白質(zhì)染色劑強(qiáng)度與對照組一致，中部(200~400 μm)的熒光強(qiáng)度約為對照組的2倍，由于內(nèi)部(500~600 μm)為顆粒活性炭，熒光強(qiáng)度基本為零。

β多糖在對照組和MBF組的顆粒內(nèi)部均勻分布；PAC強(qiáng)化型顆粒外層(0~200 μm)的β多糖染色劑熒光強(qiáng)度為對照組的1/3，內(nèi)部(300~600 μm)熒光強(qiáng)度與對照組一致；GAC強(qiáng)化型顆粒外部(0~400 μm)β多糖染色劑熒光強(qiáng)度與對照組一致，由于內(nèi)部(500~600 μm)為顆�；钚蕴浚瑹晒鈴�(qiáng)度基本為零。

EPS熒光原位染色的結(jié)果與SEM結(jié)果相印證：MBF不改變顆粒化機(jī)理，成熟的好氧顆粒污泥結(jié)構(gòu)與對照組類似；而PAC組中加入了高分子絮凝劑，起到了吸附架橋和電中和作用，改變了好氧顆粒污泥內(nèi)部結(jié)構(gòu)，形成了“蛋白外殼-β多糖內(nèi)核”的雙層結(jié)構(gòu)。外層蛋白質(zhì)含有大量疏水基團(tuán)，能夠抵抗氣-水剪切力和增加細(xì)胞疏水性^[20-21]，而內(nèi)層的β多糖有助于微生物間粘附，維持顆粒結(jié)構(gòu)穩(wěn)定^[22]；GAC組的顆粒污泥內(nèi)部僅蛋白質(zhì)的分布發(fā)生了顯著改變，高濃度的蛋白質(zhì)將顆�；钚蕴堪�裹，推測是微生物為了附著在顆粒活性炭上而分泌了更多的蛋白質(zhì)，降低微生物聚集體的表面電荷、增加疏水性，最終聚集吸附在GAC上生長^[23]。α多糖和脂肪主要由活細(xì)胞分泌^[24]，二者的分布規(guī)律表明，4種顆粒污泥主要活性微生物均分布在顆粒外層(0~300 μm)。

溶解氧在4種不同好氧顆粒污泥中的分布如圖 3所示, 蛋白質(zhì)、α多糖、β多糖、脂肪熒光染色強(qiáng)度沿半徑方向分布，篩選用于分析檢測的顆粒直徑均為1.2 mm。從圖中可知，4種顆粒徑向溶解氧開始消耗(＜5.5 mg/L)的順序為：對照組(-300 μm)、MBF組(-250 μm)、PAC組(-100 μm)、GAC組(-50 μm)，徑向溶解氧消耗殆盡(＜0.1 mg/L)的順序為：PAC組(150 μm)、GAC組(250 μm)、MBF組(300 μm)、對照組(350 μm)。

3  4種好氧顆粒污泥在測定梯度為40 μm的溶解氧分布

 

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DO外部變化：對照組和MBF溶解氧的開始消耗大幅度提前于0 μm，表明這兩組好氧顆粒污泥表面的結(jié)構(gòu)松散，與液相有一段過渡區(qū)，過渡區(qū)內(nèi)可進(jìn)行物質(zhì)傳輸、交換，但松散的結(jié)構(gòu)不利于抵抗外界沖擊負(fù)荷，且可能發(fā)生微生物游離^[25]。PAC組和GAC組的過渡區(qū)僅50~100 μm，表明這兩類顆粒結(jié)構(gòu)致密，微生物緊密附著生長，能夠良好抵抗外界沖擊。過渡區(qū)形態(tài)也能從前述的SEM結(jié)果看出，對照組和MBF組的表面存在網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，沒有清晰的固液界面，而PAC組和GAC組界面輪廓清晰分明。

DO內(nèi)部變化：從徑向溶解氧消耗殆盡的順序可知，4種好氧顆粒污泥內(nèi)部結(jié)構(gòu)從緊密到疏松的順序為PAC組＞GAC組＞MBF組＞對照組。值得特別注意的是，PAC組外層結(jié)構(gòu)比GAC組疏松，但內(nèi)部結(jié)構(gòu)PAC組更加致密。結(jié)合EPS熒光染色結(jié)果分析，這與蛋白質(zhì)的分布有關(guān)。PAC強(qiáng)化型好氧顆粒污泥的蛋白質(zhì)在外部0~200 μm段有高密度分布，GAC強(qiáng)化型顆粒的蛋白質(zhì)在中部200~400 μm段高密度分布。故推測高密度的蛋白質(zhì)會使得好氧顆粒污泥結(jié)構(gòu)更加致密，阻擋了DO進(jìn)一步向內(nèi)傳輸，而對照組和MBF組的顆粒污泥蛋白質(zhì)在整個切片斷面上都是中密度分布，因此，DO能更加深入地向內(nèi)傳輸。

主要從抗剪強(qiáng)度和抗水解強(qiáng)度兩方面研究了4種好氧顆粒污泥的結(jié)構(gòu)強(qiáng)度。由于絕對強(qiáng)度難以測定，且沒有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)方法，故用相對值表征^[17]，結(jié)果分別為完整度系數(shù)ICs(表 1)和抗水解酶系數(shù)AHCs(圖 4)。

1  4種不同好氧顆粒污泥的完整度系數(shù)ICs (相對抗剪強(qiáng)度)

數(shù)據(jù)項	對照組	PAC	MBF	GAC
ICs	92.40	98.62	96.48	98.55
誤差	00.45	00.65	01.33	00.94

下載: CSV

4  相對抗水解強(qiáng)度AHCs

 

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表 1表明，4種好氧顆粒污泥承受水力剪切力的能力從強(qiáng)到弱依次為PAC組≈GAC組＞MBF組＞對照組。ICs的結(jié)果表明，無論是投加絮凝劑還是載體物質(zhì)，都能顯著提升好氧顆粒污泥的抗剪強(qiáng)度。其中，由于PAC和GAC能顯著改變好氧顆粒污泥的外表面結(jié)構(gòu)，使得表層微生物附著、排布更加致密，從而相比于MBF更能提升顆粒抵抗水力沖刷的能力。實際運(yùn)行中，可能由于操作調(diào)控不及時，導(dǎo)致曝氣量與水量不匹配，進(jìn)一步使得反應(yīng)器內(nèi)曝氣不均勻，氣水紊流程度加劇，最終造成顆粒污泥解體、出水惡化^[5]。但是，使用強(qiáng)化型好氧顆粒污泥可有效改善此類問題的不利后果。

從圖 4可以看出，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)被水解后，PAC組和GAC組的AHCs值在85%~90%范圍內(nèi)，表明這兩組的顆粒均發(fā)生輕微解體，而對照組和MBF組的顆粒未發(fā)生解體現(xiàn)象。當(dāng)β多糖被水解后，4種顆粒污泥都發(fā)生不同程度的解體，抗β多糖水解酶能力的順序依次為：PAC組＞GAC組＞MBF組＞對照組。

已有研究證實，EPS中的β多糖具有膠狀黏性特征，是維系好氧顆粒污泥結(jié)構(gòu)完整性的主要物質(zhì)，而非傳統(tǒng)生物學(xué)觀點(diǎn)認(rèn)為的蛋白質(zhì)^[22]。許多研究用β淀粉酶對普通好氧顆粒污泥作用后均觀察和檢測到了顆粒的破碎和解體，在本實驗中也有同樣結(jié)論。但是，從AHCs結(jié)果中可以看出，4種好氧顆粒污泥水解程度顯著不同，對其原因推測如下。

由于PAC的加入，顆�；瘷C(jī)理發(fā)生改變，起決定性作用的是PAC的吸附架橋和電中和的雙重功效，故水解β多糖后顆粒僅輕微破碎。同時，由于PAC強(qiáng)化型顆粒形成了致密的蛋白外殼，也在一定程度上對顆粒結(jié)構(gòu)有保護(hù)作用，因此，在水解蛋白質(zhì)后PAC組的AHCs有輕微下降。同時，該組顆粒污泥形成了β多糖內(nèi)核，其可能原因是由于PAC的加入，使得生物殘體、無機(jī)質(zhì)等一系列物質(zhì)，在膠狀β多糖和絮凝劑PAC雙重作用下形成了類似于惰性晶核載體物質(zhì)，其具體作用機(jī)理需要進(jìn)一步深入研究；投加MBF只是增加了微生物可利用的EPS中各種物質(zhì)的種類和數(shù)量，沒有從根本上改變顆�；瘷C(jī)理，因此，水解β多糖顆粒破碎程度比較顯著，AHCs值下降明顯；而投加GAC，促使內(nèi)層微生物分泌蛋白質(zhì)附著在顆�；钚蕴勘砻嫔�長，從而改變了內(nèi)部微生物聚集機(jī)理，內(nèi)層結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性不再由β多糖決定。而EPS熒光染色結(jié)果表明其顆粒外部組分與對照組無異，導(dǎo)致β多糖水解后，外層顆粒破碎解體，內(nèi)層依舊維持一定的形態(tài)，所以，AHCs值下降程度顯著小于對照組。

對結(jié)果的分析討論表明，對照組和MBF組的顆粒污泥形成機(jī)理符合“EPS假說”，PAC組和GAC組的顆粒污泥的形成機(jī)理符合“晶核假說”^[26]。但具體的微觀形成過程，以及微生物與微生物之間、微生物與載體之間的信號傳遞、相互作用等都還需要更進(jìn)一步的深入研究。