張夢竹*，王睿，李元志

北京梅凱尼克環(huán)�？萍加邢薰�司，北京 100085；

摘要：在實際污水廠生物處理過程中，功能酶活性對于污染物的去除起著至關(guān)重要的作用。選取以Orbal氧化溝為核心工藝的實際污水處理廠為研究對象，分別分析了不同運行模式下，活性污泥中微生物種群結(jié)構(gòu)、關(guān)鍵酶活性及其與污染物去除效率之間的關(guān)系。結(jié)果表明，適當減少外側(cè)溝道內(nèi)轉(zhuǎn)刷的開啟數(shù)量，其溝道內(nèi)溶解氧分布將發(fā)生明顯變化，沿水流方向，厭氧或缺氧段明顯加長。同時，長期運行結(jié)果表明，當進水水質(zhì)穩(wěn)定時，運行參數(shù)變化并未對整個生物處理工段內(nèi)微生物種群結(jié)構(gòu)有明顯影響。相比而言，羥胺氧化還原酶（HAO）和硝酸還原酶（NR）這兩種關(guān)鍵酶的活性對于運行參數(shù)改變的響應(yīng)更為靈敏。并且，分析也表明，HAO和NR活性與氨氮及總氮去除呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.99和0.88。

關(guān)鍵詞：污水處理廠；Orbal氧化溝；轉(zhuǎn)刷；羥胺氧化還原酶；硝酸還原酶

第一作者：張夢竹（1987-），女，中級工程師，研究方向：污水及污泥處理及資源化。E-mail：zhangmengzhu@bjmbt.net

*通訊作者，E-mail：zhangmengzhu@bjmbt.net

Key words: Wastewater treatment plant; Orbal oxidation ditch; rotation brush; Hydroxylamine oxidoreductase; Nitrate reductase 

生物脫氮在目前城市污水氮素去除過程中起著重要作用[1-3]。已有研究表明，生物脫氮效率取決于硝化反硝化功能微生物的代謝活性[4]。眾多研究已經(jīng)明確了不同反應(yīng)體系下硝化反硝化功能微生物的種群結(jié)構(gòu)特征，并據(jù)此探討了脫氮效率與這些功能微生物之間的關(guān)系[5-7]。然而，在絕大多數(shù)實際污水處理廠生物處理單元中，各個處理段（好氧、缺氧、厭氧）極少是獨立分隔的，其功能段主要是依據(jù)溶解氧含量的差異進行區(qū)分。在這種情況下，不同功能段的微生物種群結(jié)構(gòu)并無明顯差異。這也使得在實際污水處理廠研究過程中，分析功能微生物差異進而說明其去除效率變得較為困難。

在氮素轉(zhuǎn)化途徑中，氨單加氧酶（AMO）和羥胺氧化還原酶（HAO）是硝化反應(yīng)的限速酶[8]，硝酸鹽原酶（NR）和亞硝酸鹽還原酶（NIR）是反硝化反應(yīng)的限速酶[9-11]。理論上，分析關(guān)鍵酶活性從而解析污染物降解過程和效率是最直接且根本的。一直以來關(guān)于生物脫氮過程中關(guān)鍵酶的研究還主要集中在酶的純化和反應(yīng)機理上[12-14]。近年來，在廢水處理過程中關(guān)于酶活性的研究已經(jīng)逐漸展開。研究者們初步分析了與TN去除相關(guān)的功能酶種類[15]，并闡述了酶活性水平與運行參數(shù)變化之間的關(guān)系[16]，探討了污水處理系統(tǒng)脫氮過程中NR和NIR的特性[17]。然而，這些研究主要集中在實驗室小試規(guī)模。事實上，實際污水處理廠運行過程比實驗室小試裝置更加復(fù)雜。因此，對于實際污水處理廠關(guān)鍵酶活性與污染物去除效率之間關(guān)系的研究是非常必要的。

氧化溝是城市污水處理的三大典型工藝之一[18]，在中國，從20世紀80年代以來，氧化溝工藝一直被廣泛采用[19]。本文以Orbal氧化溝為研究對象，分別分析了兩種運行模式下的微生物種群結(jié)構(gòu)、功能微生物含量、關(guān)鍵酶活性及污染物去除效率，并對其相互關(guān)系進行了探討。本文的目的是揭示影響實際污水處理廠污染物去除效率的內(nèi)在因素，以期為今后實際污水處理廠提標改造提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 污水處理廠運行模式概述

本研究是在河南省某市的一實際污水處理廠進行的，該污水廠主體采用Orbal氧化溝工藝，污水處理量為4×104·d-1。其進水水質(zhì)如表1所示。

研究分別在兩種模式下進行，每種模式的運行周期為一年，具體運行參數(shù)如表2所示。兩種模式的主要區(qū)別在于溝道內(nèi)轉(zhuǎn)刷開啟數(shù)量不同，模式I，外、中、內(nèi)溝道轉(zhuǎn)刷開啟數(shù)量分別為6、4、4；模式II，溝道轉(zhuǎn)刷開啟數(shù)量分別為4、4、4。每周監(jiān)測不同模式下進出水水質(zhì)，同時監(jiān)測溝道內(nèi)溶解氧變化，測試位置如圖1所示（包括轉(zhuǎn)刷后1 m和下一個轉(zhuǎn)刷前1 m）。同時，在每年6月和12月分別采集溝道內(nèi)活性污泥樣品，用于其微生物種群、功能微生物含量及關(guān)鍵酶活性分析。

表1 兩種模式下Orbal氧化溝的進水水質(zhì)

表2 兩種模式下Orbal氧化溝的運行參數(shù)

圖1 Orbal氧化溝轉(zhuǎn)刷設(shè)置模式及樣品采集及測試位點示意圖（模式Ⅰ：外溝道RB1、RB2、RB3及對應(yīng)位置全開，中、內(nèi)溝道RB1、RB2及對應(yīng)位置全開；模式Ⅱ：外、中、內(nèi)溝道均為RB1、RB3及對應(yīng)位置全開。◆代表采集及測試位點。）

1.2 功能微生物特征

將采集的活性污泥樣品，4度保存并運送回實驗室，定性和定量分析兩種模式下的功能微生物特征。

1.2.1 細菌種群結(jié)構(gòu)分析

采用現(xiàn)代分子生物學技術(shù)分析兩種運行模式下的細菌種群結(jié)構(gòu)。選用核酸自動提取儀（TanBead, 臺灣圓點，中國）分別提取其總DNA，并采用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 的提取純度。細菌通用引物F357GC/R518[20]用來擴增細菌16S rDNA片段。PCR產(chǎn)物通過聚丙烯酰胺凝膠電泳（DGGE）進行分離（凝膠濃度為8%，變形梯度為30%-60%，Bio-Rad, 美國），電泳時間為16 h。隨后采用凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad, 美國）成像并分析其多樣性[20]。

切取DGGE中的優(yōu)勢條帶，置于50 μl無菌超純水中，4 °C下過夜。采用PCR產(chǎn)物回收純化試劑盒（Cycle Pure Kit，OMEGA，美國）純化后，委托北京博邁德科技發(fā)展有限公司采用ABI 3730XL（3730XL，ABI，美國）測序儀進行測序。將測序所得的序列提交至NCBI數(shù)據(jù)庫，獲得登錄號為HQ857385-HQ857407。并利用BLAST算法在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行序列同源性比對，測序所得序列及比對序列采用MEGA 6.1軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.2 氨氧化細菌（AOB）和亞硝酸鹽氧化細菌（NOB）含量測定

采用基于SYBR Green I的熒光定量PCR（RT-PCR）技術(shù)，分析兩種運行模式下活性污泥中總細菌、AOB和NOB含量。RT-PCR（TaKaRa Code, TP800）反應(yīng)體系為25 μl，其組成為： 2.5 μl 10×PCR緩沖液、12.5 μl SYBR EX Taq預(yù)混液、0.25 μl 30 μm AOB引物和10 μm NOB引物、2 μl模板及標準16S rRNA拷貝；其反應(yīng)條件為：95°C 30s預(yù)變性，95°C 5s變性、65°C 30s延伸，往復(fù)45個循環(huán)。RT-PCR的引物如表3所示[21-23]。AOB和NOB以相應(yīng)典型菌株的PCR產(chǎn)物為標準，總細菌以大腸桿菌的PCR產(chǎn)物為標準，建立RT-PCR標準曲線。

表3 定量PCR引物序列

1.3 關(guān)鍵酶活性測定

采集運行期間溝道內(nèi)的活性污泥樣品50 ml，4 °C保存并運送回實驗室，定量分析兩種模式下的關(guān)鍵酶HAO和NR活性。首先將采集的活性污泥進行離心富集（4 °C, 15min, 12000 rpm），然后在0.01 M的磷酸鉀緩沖液（pH 7.4）中再懸浮。得到的活性污泥懸濁液通過超聲波裂解，并再次離心（4 °C, 15min, 12000 rpm）以去除固體顆粒和細胞碎片，從而得到HAO和NR粗提取物。添加不同濃度 (NH4)2SO4進行純化[24-26]。

兩種反應(yīng)混合物（A和B）分別用于HAO和NR的檢測。反應(yīng)混合物A：5 ml酶提取液，2 ml 0.5 mM細胞色素C，0.5 ml 2 mM HAc-NaAc緩沖液（pH 5.8）和0.5 ml 1.75 mM羥胺。HAO活性以反應(yīng)混合物中羥胺的減少量表示。反應(yīng)混合物B：5 ml酶提取液，1 ml甲基紫（MV+），10 ml 10 mM磷酸鉀緩沖液（pH 7.4），10 μl 10 mM DDT以及1 mM NaNO3。NR活性以反應(yīng)混合物中NaNO3的減少量表示。一個單位的酶活性（U）定義為：每克活性污泥中，每小時轉(zhuǎn)化1 mg催化底物所需酶的量。

1.4 其他分析

進出水的化學需氧量（COD）、氨氮（NH4+-N）和總氮（TN）采用國標方法進行測定[27]。溶氧（DO）和pH值采用CellOx325和SenTix 41-3分別監(jiān)測，溫度采用WTW-Multi 340i（德國）分析儀監(jiān)測。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同模式下污水處理廠運行效果

兩種運行模式下，該廠進出水中COD、NH4+-N和TN的監(jiān)測結(jié)果如圖2所示。在模式I和模式II下，COD的平均去除率分別為94.28±2.19%和91.79±2.77%；NH4+-N的平均去除率分別為72.80±7.07%和69.36±8.45%；TN的平均去除率分別為25.50±6.83%和44.67±10.96%。同時，圖中結(jié)果也表明，除冬季外，其余季節(jié)在模式II運行條件下，COD、NH4+-N和TN的去除率均明顯高于模式I。在4月到10月期間，模式I和模式II的COD的平均去除率分別為96.08±0.87%和94.17±0.73%；NH4+-N的平均去除率分別為81.38±3.47%和80.59±1.39%，TN的平均去除率分別為31.77±5.41%和59.81±5.33%。

圖2 兩種模式下污水處理廠COD、NH4+-N 和TN的去除效率

2.2 兩種模式下不同溝道DO濃度變化特征

在兩種運行模式下，分別對Orbal氧化溝三個溝道不同位置處DO濃度進行測定，結(jié)果如圖3所示。結(jié)果表明，DO濃度在轉(zhuǎn)刷前和轉(zhuǎn)刷后有明顯不同，特別是在外側(cè)溝道。模式I條件下，轉(zhuǎn)刷后1 m處外渠道的DO濃度為2.28±0.3 mg·L-1，在下一個轉(zhuǎn)刷前1m處外渠道的DO濃度為0.80±0.1 mg·L-1。在模式II條件下，轉(zhuǎn)刷后1 m處外渠道的DO濃度為2.03±0.4 mg·L-1，在下一個轉(zhuǎn)刷前1 m處外渠道的DO濃度為0.16±0.1 mg·L-1。

圖3 兩種模式下不同溝道轉(zhuǎn)刷前后溶解氧濃度變花

2.3 關(guān)鍵酶活性

分別在夏季和冬季，采集兩種運行模式下三個溝道內(nèi)活性污泥樣品，進行關(guān)鍵酶HAO和NR的活性分析。結(jié)果顯示，在同一運行模式下，與中、內(nèi)溝道相比，HAO活性在外溝道中最低。相反，NR活性在外溝道中最高。并且，HAO和NR的酶活性在夏季都高于冬季。外溝道中，在模式II條件下NR活性明顯高于模式I。模式I下，夏季和冬季的NR活性分別為1.58 mg NO3-·(g MLSS·h)-1和0.80 mg NO3-·(g MLSS·h)-1；而模式II下，夏季和冬季的NR活性分別為2.27 mg NO3-·(g MLSS·h)-1和1.07 mg NO3-·(g MLSS·h)-1。內(nèi)溝道中，模式I和模式II條件下的HAO活性并無明顯區(qū)別。模式I下，夏季和冬季的HAO活性分別為2.17 mg 羥胺·(g MLSS·h)-1和1.56羥胺mg·(g MLSS·h)-1；而模式II下，夏季和冬季的HAO活性分別為2.05 mg羥胺·(g MLSS·h)-1和1.42 mg羥胺·(g MLSS·h)-1。

3 討論

理論上，活性污泥中的微生物種群會隨著污水處理運行參數(shù)的變化而發(fā)生變化。因此，微生物種群結(jié)構(gòu)變化常用來解釋運行參數(shù)調(diào)節(jié)后污水處理效果發(fā)生變化這一現(xiàn)象[28]。本研究在一實際污水處理廠展開，研究結(jié)果顯示，當外溝道轉(zhuǎn)刷開啟數(shù)量改變后，污水廠出水中各污染物的去除效果均發(fā)生改變，尤其是TN。適當減少外溝道轉(zhuǎn)刷開啟的數(shù)量，將有助于TN的有效去除。

對兩種運行模式下不同溝道內(nèi)關(guān)鍵限速酶HAO和NR活性進行分析，結(jié)果表明，運行參數(shù)的變化直接對關(guān)鍵酶的活性產(chǎn)生了影響，尤其是本研究中外側(cè)溝道中NR的活性。在模式II下，冬季和夏季外側(cè)溝道內(nèi)NR活性分別比模式I下提高了25%和30%。與此同時，該水廠出水中TN的去除效率也由模式I的25.50±6.83%提高到了模式II的44.67±10.96%。綜合分析關(guān)鍵限速酶HAO、NR和TN、NH4+-N去除的關(guān)系。結(jié)果表明，HAO和NR活性與NH4+-N和TN的去除均呈正相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)分別為0.99和0.88（圖4）。也就是說，改變污水廠運行參數(shù)，生物處理單位中關(guān)鍵酶活性發(fā)生了明顯變化，從而改變了污染物的去除效率。

進一步分析兩種運行模式下外溝道DO濃度分布特征，發(fā)現(xiàn)減少轉(zhuǎn)刷開啟數(shù)量后，Orbal氧化溝外側(cè)溝道內(nèi)缺氧或厭氧區(qū)段有所增加。這主要是由于減少外側(cè)溝道的轉(zhuǎn)刷數(shù)量，也就減少了供氧量，從而改變了外側(cè)溝道的局部微環(huán)境條件。趙群英等學者的研究也發(fā)現(xiàn)，DO含量的變化對污水出水水質(zhì)具有明顯影響[34]。而這種微環(huán)境條件的改變，在不影響其微生物種群結(jié)構(gòu)的情況下，直接提升了溝道內(nèi)關(guān)鍵酶活性，進而提升了污水出水水質(zhì)。

也就是說，在實際污水處理廠中，改變運行參數(shù)后，相對于微生物種群結(jié)構(gòu)和功能微生物含量而言，關(guān)鍵酶活性的響應(yīng)更為快速靈敏。因此，這一研究結(jié)果對于現(xiàn)行污水處理廠提標改造是具有非常重要的實際參考依據(jù)的。

然而，本研究所采用關(guān)鍵酶活性分析僅僅是酶粗提取物的分析，并且僅在一座污水處理廠進行。如要將該方法進一步用于解析實際污水處理廠運行參數(shù)變化對處理效果影響原因時，接下來需要更為精準且廣泛的研究。例如，結(jié)合更多實際污水處理廠的研究，綜合分析多種運行參數(shù)變化后其關(guān)鍵酶的響應(yīng)過程；同時，設(shè)計小型批量研究實驗，對提取的關(guān)鍵酶進行純化，進而分析不同運行參數(shù)條件下關(guān)鍵酶的響應(yīng)關(guān)系。

圖4 HAO、NR活性與NH4+-N, TN去除率之間的相關(guān)關(guān)系

4 結(jié)論

通過實際污水處理廠運行參數(shù)的改變，可有效提高污水中污染物的去除效率。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在實際污水處理廠中，運行參數(shù)改變后，其生物反應(yīng)體系中局部環(huán)境（例如溶解氧）會及時響應(yīng)。在此過程中，微生物種群結(jié)構(gòu)在一定程度上仍然保持穩(wěn)定，并未發(fā)生明顯變化。但是其中關(guān)鍵酶的活性會隨著局部環(huán)境條件的變化而即時發(fā)生響應(yīng)，從而改善污染物的去除效率。因此，可將關(guān)鍵酶活性變化作為未來污水處理廠提標改造研究過程中重要的參考依據(jù)之一。

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